精子細胞氧化應(yīng)激活性氧（ROS）高質(zhì)熒光檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

精子細胞氧化應(yīng)激活性氧（ROS）高質(zhì)熒光檢測試劑是一種旨在使用透膜熒光染色劑氯甲基二氯二氫熒光素二乙酯，在細胞氧化條件下，產(chǎn)生熒光，來定量檢測精子細胞內(nèi)活性氧族的生成和增加的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。適用于動物和人體精子細胞的活性氧族的檢測。可以被用于細胞凋亡、衰老、代謝和營養(yǎng)學(xué)，以及發(fā)育生物學(xué)（男性不育）等的研究。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡便，性能穩(wěn)定，熒光清晰。

技術(shù)背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，甚而導(dǎo)致諸如男性不育、冠心病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤、退行性病變等各種病理狀況。其中精子細胞（spermatozoa）對于活性氧較為敏感：低濃度活性氧可以調(diào)節(jié)正常精子功能、精子獲能、頂體反應(yīng)、精卵融合等；高濃度活性氧則影響精子細胞的質(zhì)量和功能，因為精子細胞質(zhì)膜含有大量不飽和脂肪酸，胞漿含有少量的祛除活性氧的相關(guān)酶蛋白，由此活性氧容易造成精子質(zhì)膜的流動性和DNA完整性受到損害，精子運動能力降低，不能參與授精活動，zui終導(dǎo)致特發(fā)性不育癥（idiopathic infertility）。氯甲基二氯二氫熒光素二乙酯（6-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydro fluorescein diacetate, acetyl ester；CM－H2DCFDA）是取代二氯二氫熒光素二乙酯（2´,7´-dichlorodihydro fluorescin diacetate；DCFH-DA）的升級產(chǎn)品，一種*自由通過細胞膜，并在細胞內(nèi)長期滯留而不易外漏的染色劑。一旦被過氧化氫、過氧化基、過氧亞硝基陰離子等氧化，便產(chǎn)生熒光。據(jù)此測定精子細胞內(nèi)活性氧族的濃度。 

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）   毫升

染色液（Reagent B）   微升

稀釋液（Reagent C）   毫升

保存液（Reagent D）        毫升

產(chǎn)品說明書     1份

保存方式

保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，嚴格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

2毫升離心管：用于樣品操作的容器

細胞培養(yǎng)箱：用于樣品孵育

微型臺式離心機：用于樣品操作

血細胞計數(shù)器：用于精子細胞計數(shù)

（共聚焦）熒光顯微鏡或：用于觀察熒光精子細胞

熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于精子細胞熒光定量分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀釋液（Reagent C）放進37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出xx微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升稀釋液（Reagent C），混勻后，標(biāo)記為染色工作液，置入暗室里。然后進行下列操作。

• 移取2毫升新鮮收集（1小時內(nèi)）的精液到2毫升離心管
• 放進37℃培養(yǎng)箱孵育20分鐘
• 放進微型臺式離心機離心7分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻精子細胞顆粒群
• 放進臺式離心機離心7分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入適量的清理液（Reagent A）
• 充分混勻后，在血細胞計數(shù)器上進行精子細胞計數(shù)
• 調(diào)整精子細胞數(shù)為1 X 107/毫升
• （選擇步驟）放進37℃培養(yǎng)箱里備用（1小時內(nèi)）
• 放進微型臺式離心機離心7分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升含有染色液（Reagent B）和稀釋液（Reagent C）的染色工作液，輕柔混勻
• 放進37℃恒溫水槽孵育40分鐘，避免光照
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入預(yù)冷的xx微升保存液（Reagent D），輕柔混勻細胞顆粒群
• 放進冰槽里
• 選擇下列方式之一進行操作：

• 或使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：

1）移取10微升上述精子細胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片

2）激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長530nm――

綠色熒光增強，表明活性氧族（ROS）含量高

• 或使用熒光分光光度儀檢測（定量檢測）：

1）移取400微升上述精子細胞懸液到1毫升比色杯

2）加入xx微升保存液（Reagent D）

3）上下傾倒混勻數(shù)次

4）放進熒光分光光度儀：激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長530nm――

RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量高

注意事項

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時須戴手套
• 建議無菌操作，尤其不可污染母液
• 樣品檢測前，建議在血細胞計數(shù)器上進行精子細胞計數(shù)
• 精子細胞計數(shù)時乘上稀釋倍數(shù)104。標(biāo)準血細胞計數(shù)器（Hemocytometer）的計算方法是：

1毫米方塊的細胞計數(shù)X 104（稀釋倍數(shù)）＝實際細胞數(shù)/毫升

• 染色完成后，即刻進行檢測分析，否則影響檢測
• 本產(chǎn)品也可用于凍存精子細胞的檢測分析
• 如果背景過深，調(diào)整染色工作液使用劑量（1：200至1：1000容量比），避免過度染色
• 本公司提供陽性對照甲萘醌溶液（12041），觀察細胞熒光增強現(xiàn)象
• 正常精子細胞活性氧陽性率較低，通常為小于4%
• 如果需要使用流式細胞儀分析，建議使用精子細胞氧化應(yīng)激活性氧（ROS）細胞流式儀檢測試劑盒—14033
• 本公司提供系列發(fā)育生物學(xué)相關(guān)檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰

使用承諾

秉著“信譽至上、客戶滿意、質(zhì)量承諾”的宗旨為我們的用戶提供產(chǎn)品和服務(wù)。用戶收到貨后，應(yīng)按照產(chǎn)品說明書上的規(guī)定妥善保管并在有效期內(nèi)使用。我們的產(chǎn)品在銷售前已作嚴格的質(zhì)量鑒定，保證說明書所述的使用效果。在貨到后10天內(nèi)若發(fā)現(xiàn)確屬本產(chǎn)品的質(zhì)量問題，請立即以書面形式（實驗報告）與本公司，并將該產(chǎn)品退回，經(jīng)檢驗確系產(chǎn)品質(zhì)量所致，本公司負責(zé)更換產(chǎn)品。如系使用者錯誤操作所致，本公司不承擔(dān)由此造成的損失。

友情提醒

IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

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編號 名稱 規(guī)格

14036.1 精子細胞氧化應(yīng)激活性氧高質(zhì)熒光檢測試劑盒 20次

14036.1A 清理液（Reagent A） 毫升

14036.1B 染色液（Reagent B） 微升

14036.1C 稀釋液（Reagent C） 毫升

14036.1D 保存液（Reagent D） 毫升

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